研究报告化疗药物体外诱导急性髓系白血病细胞凋亡的临床意义许小平史剑慧程文英王健民训杰果我们采用TdT介导的脱氧核苷酸切口和缺口末端标记法（1UNEL）及超微结构观察等方法，对18例初治急性髓系白血病（AML）患者骨髓白血病细胞进行体外化疗药物诱导凋亡与临床疗效关系的初步研究，以探讨体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡在临床化疗疗效预测中的实际应用。

　　病例和方法1病例和标本18例初治AML患者来自第二军医大学长海医院血液科和上海医科大学华山医院血液科。其中男8例，女10例；中位年龄46岁（14~ 1例。所有患者均经形态学、细胞化学（M7经电镜及单抗）检测确诊。化疗采用HA（高三尖杉酯碱2~ 150mg/m2）方案。完全缓解（CR）与未缓解（NR）判别按国内现行标准。化疗前抽取新鲜骨髓，抗凝，用分离液分离单个核细胞备用。

　　2化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡单个核细胞浓度为1X106/ml，分别孵育于①高三尖杉酯碱（HHT）2mg/L②柔红（1.0mol/L），作用18h以上药物终浓度的选择万景华等的方法及我们的实验结果。

　　3白血病细胞bcl-2表达检测所用单抗bd-2（124）购自上海华美公司（丹麦DAKO公司产品）HRP-DAB药盒购自美国Labvisiom公司。细胞涂片（细胞浓度为2X 106/ml）后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。加bc-2单抗，37°C湿盒作用30min加生物素化二抗，室温作用10min，加辣根酶标记链霉亲和素工作液（Streptavidin/HRP）室温作用10min后以3 3-二氨基联苯胺（DAB）染色。计数1000个细胞中的阳性细胞，并计算其阳性率。参照10例良性血液病患者的结果，bc-2表> 15为阳性。

　　4凋亡检测41 Wkigh-Giemsa染色：细胞离心涂片染色，光镜下计数具有明显凋亡特征的细胞（细胞缩小，核染色质凝聚，核碎裂等）42TUNEL法检测片段化DNA主要步骤为用体积分数为1的甲醛固定细胞，以TritonX-100穿透细胞，洗涤后滴片，晾干。用dUTP-荧光素标记试剂盒（购自德国保灵曼公司上海分公司）进行温育反应（每份标本均设立阴性对照，即不加关键的TdT酶）然后加抗荧光素-AP，再加底物5-溴-4- -3-吲哚暮磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT），将基于荧光素的TUNEL检测转化为显色法。阳性细胞被染成蓝黑色。

　　计数1000个细胞中阳性细胞数，并以骨髓分离后白血病细胞比例作校正。

　　43透射电镜标本制备：细胞用PBS洗涤后，用戊二醛和锇酸固定后进行漂洗、脱水、包埋、超薄切片，染色并晾干后以透射电镜观察细胞内超微结构。

　　5统计学分析实验数据分析采用两样本均数比较的t检验及/检验。

　　结1化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡结果见表1表1结果表明，CR患者化疗前白血病细胞体外对化疗药物的敏感性均高于NR患者（P值均<0.05）在所有的实验组中，TUNEL标记法的敏感性普遍高于Wright-Giemsa染色法。

　　2白血病细胞bc-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系结果见表2表1AML患者化疗前体外化疗药诱导白血病细胞凋亡率（，x士s）组别例数CR组NR组学华山医院血液学研究室（丁训杰）表2白血病细胞bc-2表达与体外化疗药物诱导凋亡及临床疗效的关系小体易见。

　　讨别性号例龄年岁亡凋f 2达表断诊效疗案化方男男男女男男男男女女女男女女女女女女亡值（TLNEL法检测结果）表2显示11例获CR者化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为40~65，7例bd-2表达阴性；7例NR者，化疗药物诱导凋亡细胞的百分率为21 ~31，6例bc-2表达阳性。

　　3化疗药物浓度和作用时间与诱导白血病细胞凋亡的关系结果见表3表3不同浓度化疗药物作用不同时间白血病细胞凋亡率的比较组别不同时间凋亡细胞（）6h12h18h对照组1.53454HHT组2临床上对初治患者合理地选用诱导凋亡敏感的药物是患者获得长期持续缓解的重要因素。国外学者近年来在这方面已作了一些探索。Csoka等采用化疗初6h外周血幼稚淋巴细胞凋亡指数评估急性淋巴细胞白血病（ALL）对糖皮质激素的敏感性，结果显示凋亡率与临床疗效有很好的相关性。Smith等研究39例初发AML患者体外诱导凋亡与临床疗效的关系，发现化疗获CR者，白血病细胞体外无血清培养24h后自发凋亡率平均为19.5（3.6~64.0）；相反，未能CR者凋亡细胞平均仅为42（1.8 0）提示体外化疗药物诱导凋亡的敏感性对于预测化疗预后有一定的指导意义。

　　我们对18例AML患者体外化疗药物诱导凋亡的研究显示，11例患者的骨髓白血病细胞对DNR+AnrC或HHT+AnrC，TUNEL法检测凋亡细胞比例高达40~65，临床化疗均获得CR.相反，其余7例在同样条件下对上述药物诱导凋亡不敏感者，临床采用DA或HA方案化疗均未能达到治患者白血病细胞凋亡的我们认为，对于初发AML胞凋亡敏感性的检测可作至于初发的ALL及难治疗药物诱导凋亡敏感性的于影响化疗药物诱导白血取决于细胞对药物摄取的I示，AML初治患者骨髓细则预后较好。

　　缓解，表明化疗药物诱导AML初作用体内与体外基本一致。由此患者，体外化疗药物诱导白血病细为一项化疗疗效预测的有用指标。

　　与复发的急性白血病患者，体外化临床意义如何，尚在研究之中。关病细胞凋亡的因素较为复杂，不少bd-2关系密切，但也有持不同看法例AML患者的体外研究表明，白it的敏感性与bcl-2表达无关，而只累积量大小。我们的观察结果则J胞bc-2高表达者CR率低，反之，a 1万景华，殷建林，卞寿庚，等。急性非验的研究。中华血液学杂志，1989，1（献：淋巴细胞白血病综合药敏试表3示例9患者白血病细胞不同浓度化疗药物作用不同时间的细胞凋亡率。从表中可以看出，该患者白血病细胞对三种化疗药物诱导凋亡均呈现浓度和时间依赖关系。

　　4形态学变化经化疗药物作用的白血病细胞在光镜下出现典型的凋亡形态特征，即细胞体积缩小、核固缩、染色质凝集，并有凋亡小体形成。电镜下观察，胞质空泡化，各种细胞器均出现不同程度的萎缩，胞膜尚完整，核固缩、碎裂，凋亡（校对：王汝瑞）