脑提取物经Sep-Pak柱初步纯化幼虫的脑提取物经Sep-Pak柱初步纯化，具体步骤如下（流速为1mL/h）：（1）反相C18Sep-Pak柱的预处理，依次用5mL含011三氟乙酸（TFA）的011牛血清白蛋白（BSA）溶液，痔疮套扎器5mL含011TFA的17乙腈溶液和5mL011TFA溶液洗柱子；（2）装填，每个Sep-Pak柱装填250个脑当量的幼虫脑提取物，重复3次；（3）洗脱，依次用5mL011TFA溶液，5mL含011TFA的17乙腈溶液和3mL含011TFA的40乙腈溶液，收集含AS活性的组分，经N2流吹去挥发性物质，然后冷冻干燥，-80e保存，供HPLC分离。

　　HPLC分离来自上述步骤的相当于250个脑当量的含AS活性的洗脱组分，用011TFA溶液稀释至250LL，装填到319mm@150mm的反向C18柱（填料颗粒5Lm，孔径90üA，Waters公司）上，HPLC是在Waters600E型和486型检测器上进行。溶剂A为011TFA水溶液，溶剂B为011TFA的80的甲醇溶液，洗脱梯度为5到95B液60min，95B液10min，流速为1mL/min，洗脱组分的检测波长为280nm.按每分钟收集洗脱组分，然后进行AS活性测定。

　　用于活性测定的各分离组分的储存和制备经HPLC分离的甲醇洗脱组分（含011TFA）储存在-80b或立即分析。用于活性测定的组分，取一定量转移到115mL含10LL011BSA的离心管中，N2吹干，生测时用1mol/LHCl10LL重新悬浮，加入适量的培养液，再用1mol/LNaOH中和，进行CA的培养。

　　AS活性的测定幼虫脑提取物及经Sep-Pak柱和HPLC分离所收集的各组分中AS样物质的活性测定，采用离体放射化学的方法，即对离体CA合成JH能力的影响。按Feyerensen和Tobe、Tobe和Clark的方法并加以改进。JH合成是以L-（3H-甲基）蛋氨酸（比活200mci/mmol，NEN公司）的掺入来检测的，用异辛烷提取JH之前，将CA从培养液中移去，合成速率代表释放到培养液中的标记激素。CA在50LL含3H-甲基蛋氨酸（终浓度为50Lmol/L）的TC199培养液中培养3h来估计正常的合成速率，然后将CA移到含有脑提取物或各分离组分的培养液中再培养3h，作为JH合成的处理速率，则JH合成速率变化的百分比为（1-处理速率/正常速率）@100，来表示CA被抑制的程度。

　　胰蛋白酶对脑提取物中AS活性物质的影响幼虫的脑提取物与胰蛋白酶溶液（0101mol/LTris-HCl缓冲液，pH718，终浓度为1mg/L）一起，37e温育4h，然后将上述混合液煮沸20min，静脉显示仪使多余的酶失活，检测AS的活性。